Interferensiefaktore in PCR-reaksies

Tydens die PCR-reaksie word dikwels 'n paar interfererende faktore teëgekom.
As gevolg van die baie hoë sensitiwiteit van PCR, word kontaminasie beskou as een van die belangrikste faktore wat PCR-resultate beïnvloed en kan dit vals positiewe resultate lewer.
Net so krities is die verskeie bronne wat tot vals-negatiewe resultate lei. Indien een of meer noodsaaklike dele van die PCR-mengsel of die amplifikasiereaksie self geïnhibeer of versteur word, kan die diagnostiese toets belemmer word. Dit kan lei tot verminderde doeltreffendheid en selfs vals-negatiewe resultate.
Benewens inhibisie, kan verlies aan teikennukleïensuurintegriteit voorkom as gevolg van versendings- en/of bergingstoestande voor monstervoorbereiding. In die besonder kan hoë temperature of onvoldoende berging lei tot skade aan selle en nukleïensure. Sel- en weefselfiksasie en paraffieninbedding is bekende oorsake van DNS-fragmentasie en 'n aanhoudende probleem (sien Figure 1 en 2). In hierdie gevalle sal selfs optimale isolasie en suiwering nie help nie.

Figuur 1 | Effek van immobilisasie op DNS-integriteit
Agarosegelelektroforese het getoon dat die kwaliteit van die DNS wat uit paraffiensnitte van outopsies geïsoleer is, aansienlik gewissel het. DNS van verskillende gemiddelde fragmentlengtes was in die ekstrakte teenwoordig, afhangende van die fiksasiemetode. DNS is slegs bewaar wanneer dit in inheemse bevrore monsters en in gebufferde neutrale formalien gefikseer is. Die gebruik van 'n sterk suur Bouin-fikseermiddel of ongebufferde, miersuurbevattende formalien het 'n beduidende verlies aan DNS tot gevolg gehad. Die oorblywende fraksie is hoogs gefragmenteerd.
Aan die linkerkant word die lengte van fragmente uitgedruk in kilobasepare (kbp)

Figuur 2 | Verlies aan integriteit van nukleïensuurteikens
(a) 'n 3′-5′ gaping op beide stringe sal lei tot 'n breuk in die teiken-DNS. Sintese van DNS sal steeds op die klein fragment plaasvind. As 'n primer-annealingplek egter op die DNS-fragment ontbreek, vind slegs lineêre amplifikasie plaas. In die gunstigste geval kan die fragmente mekaar herversadig, maar die opbrengste sal klein en onder deteksievlakke wees.
(b) Verlies van basisse, hoofsaaklik as gevolg van depurinering en timidien-dimeervorming, lei tot 'n afname in die aantal H-bindings en 'n afname in Tm. Gedurende die verlengde opwarmingsfase sal die primers van die matriks-DNS wegsmelt en nie selfs onder minder streng toestande uitgloei nie.
(c) Aangrensende timienbasisse vorm 'n TT-dimeer.
Nog 'n algemene probleem wat dikwels in molekulêre diagnostiek voorkom, is die minder-as-optimale vrystelling van teikennukleïensure in vergelyking met fenol-chloroform-ekstraksie. In uiterste gevalle kan dit geassosieer word met vals negatiewe. Baie tyd kan bespaar word deur kooklise of ensiematiese vertering van selrommel, maar hierdie metode lei dikwels tot lae PCR-sensitiwiteit as gevolg van onvoldoende nukleïensuurvrystelling.

Inhibisie van polimerase-aktiwiteit tydens amplifikasie

Oor die algemeen word inhibisie as 'n houerkonsep gebruik om alle faktore te beskryf wat tot suboptimale PCR-resultate lei. In 'n streng biochemiese sin is inhibisie beperk tot die aktiwiteit van die ensiem, d.w.s. dit verminder of voorkom substraat-produk-omskakeling deur interaksie met die aktiewe plek van die DNA-polimerase of sy kofaktor (bv. Mg2+ vir Taq DNA-polimerase).
Komponente in die monster of verskeie buffers en ekstrakte wat reagense bevat, kan die ensiem direk inhibeer of sy kofaktore (bv. EDTA) vasvang, waardeur die polimerase inaktiveer word en weer lei tot verlaagde of vals negatiewe PCR-resultate.
Baie interaksies tussen reaksiekomponente en teikenbevattende nukleïensure word egter ook as 'PCR-inhibeerders' aangewys. Sodra die integriteit van die sel deur isolasie ontwrig word en die nukleïensuur vrygestel word, kan interaksies tussen die monster en die omliggende oplossing en vaste fase plaasvind. Byvoorbeeld, 'aasdiere' kan enkel- of dubbelstrengige DNS bind deur nie-kovalente interaksies en inmeng met isolasie en suiwering deur die aantal teikens wat uiteindelik die PCR-reaksievat bereik, te verminder.
Oor die algemeen is PCR-inhibeerders teenwoordig in die meeste liggaamsvloeistowwe en reagense wat gebruik word vir kliniese diagnostiese toetse (ureum in urine, hemoglobien en heparien in bloed), dieetaanvullings (organiese komponente, glikogeen, vet, Ca2+-ione) en komponente in die omgewing (fenole, swaar metale).

Meer algemene PCR-inhibeerders kan gevind word in bakterieë en eukariotiese selle, nie-teiken-DNS, DNS-bindende makromolekules van weefselmatrikse en laboratoriumtoerusting soos handskoene en plastiek. Suiwering van nukleïensure tydens of na ekstraksie is die voorkeurmetode vir die verwydering van PCR-inhibeerders.
Vandag kan verskeie outomatiese ekstraksietoerusting baie handmatige protokolle vervang, maar 100% herwinning en/of suiwering van teikens is nog nooit bereik nie. Potensiële inhibeerders kan steeds in die gesuiwerde nukleïensure teenwoordig wees of reeds in werking getree het. Verskillende strategieë bestaan ​​om die impak van inhibeerders te verminder. Die keuse van die toepaslike polimerase kan 'n beduidende impak op inhibeerderaktiwiteit hê. Ander bewese metodes om PCR-inhibisie te verminder, is die verhoging van polimerasekonsentrasie of die toediening van bymiddels soos BSA.
Inhibisie van PCR-reaksies kan gedemonstreer word deur die gebruik van interne proseskwaliteitsbeheer (IPC).
Sorg moet gedra word om alle reagense en ander oplossings in die ekstraksiestel, soos etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol en fenol, van die nukleïensuurisolaat te verwyder deur 'n deeglike wasstap. Afhangende van hul konsentrasie, kan hulle PCR aktiveer of inhibeer.