Interferensiefaktore in PCR-reaksies

Tydens die PCR-reaksie word sommige faktore wat inmeng dikwels teëgekom.
As gevolg van die baie hoë sensitiwiteit van PCR, word kontaminasie beskou as een van die belangrikste faktore wat PCR-resultate beïnvloed en kan vals positiewe resultate lewer.
Ewe krities is die verskillende bronne wat lei tot vals-negatiewe resultate. As een of meer noodsaaklike dele van die PCR-mengsel of die amplifikasiereaksie self geïnhibeer of daarmee ingemeng word, kan die diagnostiese toets belemmer word. Dit kan lei tot verminderde doeltreffendheid en selfs vals negatiewe resultate.
Benewens inhibisie, kan verlies van teikennukleïensuurintegriteit voorkom as gevolg van versending en/of bergingstoestande voor monstervoorbereiding. Veral hoë temperature of onvoldoende berging kan lei tot skade aan selle en nukleïensure. Sel- en weefselfiksasie en paraffieninbedding is bekende oorsake van DNA-fragmentasie en 'n aanhoudende probleem (sien Figuur 1 en 2). In hierdie gevalle sal selfs optimale isolasie en suiwering nie help nie.

Figuur 1 | Effek van immobilisasie op DNA-integriteit
Agarosegelelektroforese het getoon dat die kwaliteit van die DNA wat uit paraffienseksies van lykskouings geïsoleer is, aansienlik verskil. DNA van verskillende gemiddelde fragmentlengtes was teenwoordig in die ekstrakte, afhangende van die fiksasiemetode. DNA is slegs bewaar wanneer dit in inheemse bevrore monsters en in gebufferde neutrale formalien gefixeer is. Die gebruik van 'n sterk suur Bouin-fikseermiddel of ongebufferde, mieresuur-bevattende formalien het 'n beduidende verlies aan DNA tot gevolg gehad. Die oorblywende fraksie is hoogs gefragmenteerd.
Aan die linkerkant word die lengte van fragmente uitgedruk in kilobasispare (kbp)

Figuur 2 | Verlies aan integriteit van nukleïensuurteikens
(a) 'n 3′-5′ gaping op beide stringe sal lei tot 'n breuk in die teiken DNS. sintese van DNA sal steeds op die klein fragment plaasvind. As 'n primer-gloeiplek egter op die DNA-fragment ontbreek, vind slegs lineêre amplifikasie plaas. In die gunstigste geval kan die fragmente mekaar weer versadig, maar die opbrengs sal klein wees en onder opsporingsvlakke wees.
(b) Verlies aan basisse, hoofsaaklik as gevolg van depurinering en timidien dimeer vorming, lei tot 'n afname in die aantal H-bindings en 'n afname in Tm. Tydens die verlengde opwarmingsfase sal die primers wegsmelt van die matriks-DNS en sal selfs onder minder streng toestande nie uitgloei nie.
(c) Aangrensende timienbasisse vorm 'n TT-dimeer.
Nog 'n algemene probleem wat dikwels in molekulêre diagnostiek voorkom, is die minder-as-optimale vrystelling van teikennukleïensure in vergelyking met fenol-chloroform-ekstraksie. In uiterste gevalle kan dit geassosieer word met vals negatiewe. Baie tyd kan bespaar word deur kooklise of ensiematiese vertering van selafval, maar hierdie metode lei dikwels tot lae PCR-sensitiwiteit as gevolg van onvoldoende vrystelling van nukleïensuur.

Inhibisie van polimerase-aktiwiteit tydens amplifikasie

Oor die algemeen word inhibisie as 'n houerkonsep gebruik om alle faktore te beskryf wat tot suboptimale PKR-resultate lei. In 'n streng biochemiese sin is inhibisie beperk tot die aktiwiteit van die ensiem, dit wil sê dit verminder of voorkom substraat-produk omskakeling deur interaksie met die aktiewe plek van die DNA-polimerase of sy kofaktor (bv. Mg2+ vir Taq DNA-polimerase).
Komponente in die monster of verskeie buffers en ekstrakte wat reagense bevat, kan die ensiem direk inhibeer of die kofaktore daarvan vasvang (bv. EDTA), en sodoende die polimerase inaktiveer en op sy beurt lei tot verminderde of vals negatiewe PKR-resultate.
Baie interaksies tussen reaksiekomponente en teikenbevattende nukleïensure word egter ook as 'PCR-inhibeerders' aangewys. Sodra die integriteit van die sel deur isolasie ontwrig is en die nukleïensuur vrygestel word, kan interaksies tussen die monster en sy omringende oplossing en vaste fase plaasvind. Byvoorbeeld, 'aasvreters' kan enkel- of dubbelstring-DNS bind deur nie-kovalente interaksies en inmeng met isolasie en suiwering deur die aantal teikens wat uiteindelik die PCR-reaksievat bereik, te verminder.
Oor die algemeen is PCR-inhibeerders teenwoordig in die meeste liggaamsvloeistowwe en reagense wat gebruik word vir kliniese diagnostiese toetse (ureum in urine, hemoglobien en heparien in bloed), dieetaanvullings (organiese komponente, glikogeen, vet, Ca2+ ione) en komponente in die omgewing (fenole) , swaar metale)

Meer algemene PCR-inhibeerders kan gevind word in bakterieë en eukariotiese selle, nie-teiken-DNS, DNA-bindende makromolekules van weefselmatrikse en laboratoriumtoerusting soos handskoene en plastiek. Suiwering van nukleïensure tydens of na ekstraksie is die voorkeurmetode vir die verwydering van PCR-inhibeerders.
Vandag kan verskeie outomatiese onttrekkingstoerusting baie handprotokolle vervang, maar 100% herstel en/of suiwering van teikens is nog nooit bereik nie. Potensiële inhibeerders kan steeds in die gesuiwerde nukleïensure teenwoordig wees of het dalk reeds in werking getree. Verskillende strategieë bestaan ​​om die impak van inhibeerders te verminder. Die keuse van die toepaslike polimerase kan 'n beduidende impak op inhibeerderaktiwiteit hê. Ander bewese metodes om PCR-inhibisie te verminder, is die verhoging van polimerasekonsentrasie of die toepassing van bymiddels soos BSA.
Inhibisie van PCR-reaksies kan gedemonstreer word deur die gebruik van interne proseskwaliteitbeheer (IPC).
Sorg moet gedra word om alle reagense en ander oplossings in die ekstraksiestel, soos etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol en fenol, uit die nukleïensuurisolaat te verwyder deur 'n deeglike wasstap. Afhangende van hul konsentrasie, kan hulle PCR aktiveer of inhibeer.