Interferensie faktore in PCR -reaksies

Tydens die PCR -reaksie word daar gereeld sommige inmengende faktore voorkom.
As gevolg van die baie hoë sensitiwiteit van PCR, word besoedeling beskou as een van die belangrikste faktore wat PCR -resultate beïnvloed en kan dit vals positiewe resultate lewer.
Die verskillende bronne wat tot vals-negatiewe resultate lei, is net so krities. As een of meer noodsaaklike dele van die PCR -mengsel of die amplifiseringsreaksie self geïnhibeer of inmeng word, kan die diagnostiese toetsing belemmer word. Dit kan lei tot verminderde doeltreffendheid en selfs vals negatiewe resultate.
Benewens die remming, kan die verlies aan teikennukleïensuurintegriteit voorkom as gevolg van aflewering en/of opbergtoestande voor die voorbereiding van die monster. In die besonder kan hoë temperature of onvoldoende opberging lei tot skade aan selle en nukleïensure. Sel- en weefselbevestiging en paraffieninbedding is bekende oorsake van DNA -fragmentasie en 'n aanhoudende probleem (sien Figuur 1 en 2). In hierdie gevalle sal selfs optimale isolasie en suiwering nie help nie.

Figuur 1 | Effek van immobilisasie op DNA -integriteit
Agarose -gel -elektroforese het getoon dat die kwaliteit van die DNA wat van paraffiengedeeltes van outopsies geïsoleer is, aansienlik verskil. Afhangend van die fiksasiemetode, was DNA van verskillende gemiddelde fragmentlengtes in die uittreksels aanwesig. DNA is slegs bewaar toe dit in inheemse bevrore monsters vasgemaak is en in gebufferde neutrale formalien. Die gebruik van 'n sterk suur bouien-fixatiewe of ongepaste, miersuurbevattende formalien het gelei tot 'n beduidende verlies aan DNA. Die oorblywende breuk is baie gefragmenteerd.
Aan die linkerkant word die lengte van fragmente uitgedruk in kilobase pare (kbp)

Figuur 2 | Verlies aan integriteit van nukleïensuurteikens
(A) 'n Gap van 3′-5 ′ op albei stringe sal lei tot 'n onderbreking in die teiken-DNA. Sintese van DNA sal steeds op die klein fragment voorkom. As 'n primer -uitgloeiingsplek egter op die DNA -fragment ontbreek, vind slegs lineêre versterking plaas. In die gunstigste geval kan die fragmente mekaar herversper, maar die opbrengste sal klein wees en onder die opsporingsvlakke.
(b) Verlies van basisse, hoofsaaklik as gevolg van depurinering en vorming van tymidien dimeer, lei tot 'n afname in die aantal H-bindings en 'n afname in TM. Tydens die langwerpige opwarmingsfase sal die primers van die matriks -DNA wegsmelt en sal dit nie onder minder streng toestande uitgloei nie.
(c) Aangrensende timienbasisse vorm 'n TT -dimeer.
'N Ander algemene probleem wat dikwels by molekulêre diagnostiek voorkom, is die minder as optimale vrystelling van teikennukleïensure in vergelyking met fenol-chloroform-ekstraksie. In ekstreme gevalle kan dit geassosieer word met valse negatiewe. Baie tyd kan gestoor word deur kooklise of ensiematiese vertering van selpuin te kook, maar hierdie metode lei dikwels tot 'n lae PCR -sensitiwiteit as gevolg van onvoldoende vrystelling van nukleïensuur.

Inhibisie van polimerase -aktiwiteit tydens versterking

Oor die algemeen word remming as 'n houerkonsep gebruik om alle faktore wat tot suboptimale PCR -resultate lei, te beskryf. In 'n streng biochemiese sin is die remming beperk tot die aktiwiteit van die ensiem, dit wil sê, dit verminder of voorkom die omskakeling van substraatprodukte deur interaksie met die aktiewe plek van die DNA-polimerase of sy kofaktor (bv. Mg2+ vir TAQ DNA-polimerase).
Komponente in die monster of verskillende buffers en uittreksels wat reagense bevat, kan die ensiem direk belemmer of sy kofaktore (bv. EDTA) vasvang, waardeur die polimerase inaktiveer en op sy beurt lei tot verminderde of vals negatiewe PCR -resultate.
Baie interaksies tussen reaksiekomponente en teikenbevattende nukleïensure word egter ook as 'PCR-remmers' aangewys. Sodra die integriteit van die sel deur isolasie ontwrig word en die nukleïensuur vrygestel word, kan interaksies tussen die monster en die omliggende oplossing en vaste fase plaasvind. Byvoorbeeld, 'Scavengers' kan enkel- of dubbelstrengs DNA bind deur nie-kovalente interaksies en die isolasie en suiwering beïnvloed deur die aantal teikens wat uiteindelik die PCR-reaksiegevaart bereik, te verminder.
Oor die algemeen is PCR -remmers teenwoordig in die meeste liggaamsvloeistowwe en reagense wat gebruik word vir kliniese diagnostiese toetse (ureum in urine, hemoglobien en heparien in bloed), dieetaanvullings (organiese komponente, glikogeen, vet, Ca2+ -ione) en komponente in die omgewing (fenole, swaar metale)

Meer algemene PCR-remmers kan gevind word in bakterieë en eukariotiese selle, nie-teiken DNA, DNA-bindende makromolekules van weefselmatrikse en laboratoriumtoerusting soos handskoene en plastiek. Suiwering van nukleïensure tydens of na ekstraksie is die voorkeurmetode om PCR -remmers te verwyder.
Verskeie outomatiese onttrekkingsapparaat kan deesdae baie handmatige protokolle vervang, maar 100% herstel en/of suiwering van teikens is nog nooit bereik nie. Potensiële remmers kan steeds in die gesuiwerde nukleïensure teenwoordig wees, of dit kan reeds in werking getree het. Daar bestaan ​​verskillende strategieë om die impak van remmers te verminder. Die keuse van die toepaslike polimerase kan 'n beduidende invloed op die remmeraktiwiteit hê. Ander beproefde metodes om PCR -remming te verminder, is om die polimerase -konsentrasie te verhoog of bymiddels soos BSA toe te pas.
Inhibisie van PCR -reaksies kan gedemonstreer word deur die gebruik van interne prosesgehaltebeheer (IPC).
Sorg moet gedra word dat alle reagense en ander oplossings in die ekstraksiekit, soos etanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol en fenol, uit die nukleïensuurisolaat deur 'n deeglike wasstap. Afhangend van hul konsentrasie, kan hulle PCR aktiveer of inhibeer.